光片显微镜的崛起 | 三维成像的革命
在生命科学研究中，传统宽场显微镜和共聚焦显微镜已得到广泛应用，但存在光毒性高、成像速度慢等问题。为了解决这些问题，2004 年德国 Stelzer 课题组[1]首次发明光片荧光显微镜（LSFM），它通过薄层光片选择性照明样品，创建一个与检测轴正交的薄激发光片来照亮样本的一个平面，从而减少了样本的光暴露，降低了光漂白和光毒性的风险，同时可实现高速三维成像[2]，使针对活体的长时间成像成为可能，成为胚胎发育、神经科学和肿瘤等领域研究的重要工具。
光片扫过样本以产生 3D 图像[3]
然而，单一模态的光片显微镜不能适用于多种应用场景，因此其模态历经了多次变化。从最初的正交双物镜和正置 V 形双物镜显微镜，到八字开顶型双物镜显微镜，再到如今备受瞩目的单物镜光片显微镜，它的每一次进化都在突破应用和成像的极限。今天，我们就来聊聊光片显微镜的“变形记”。
第一代：正交双物镜光片显微镜——细胞级分辨率但易用性差
最早的光片显微镜采用“双物镜正交设计”——一个物镜负责照明（生成光片），另一个垂直放置的物镜负责成像，如图a，多用于脑科学和神经科学领域。
为了提升易用性，研究者开发了正置 V 形双物镜显微镜，通过倾斜光路适配5 mm 圆形载玻片，如图b，多用于细胞样本成像。
a：经典正交双物镜成像示意图[4]；
b：正置 V 形双物镜成像示意图[5]。
这种设计虽然简单，但问题也很明显：
1.横向分辨率受限：高数值孔径（NA）物镜的工作距离短，但双物镜结构要求照明物镜有较长工作距离，难以使用油镜，因此只有低 NA 物镜，能够应用于光片成像。（NA≤1.1，对应分辨率约 300 nm）。
2. 无法适配常规载具：操作空间受限，传统正交物镜的样品必须悬空固定，无法使用常规载玻片或培养皿。正置 V 形双物镜的载具只能是 5 mm 圆形薄玻片，常规载玻片、培养皿和孔板不能适配。
3. 应用场景单一：无法满足多尺度、多类型样本的成像需求。例如，单台仪器仅能适配特定尺寸或固定形态的样本，难以覆盖从亚细胞到组织水平的多尺度观测需求。
虽然第一代光片显微镜相对于共聚焦显微镜光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，且无法适配常规载具。
第二代：八字开顶型双物镜显微镜——易用性改善但是性能妥协
为了解决第一代光片显微镜无法适配常规载具，学习和使用成本高的问题，开发者开发了八字开顶型双物镜--倒置光片显微镜，让样品放置更符合常规实验习惯。
倒置配置是标准样品载具可用于高分辨率显微技术的重要先决条件，该配置带来的弊端主要是成像会产生荧光信号的畸变，因为荧光从样品中发射，经过水相细胞培养基、倾斜的玻璃盖玻片和水介质，然后进入检测物镜。为了解决荧光信号畸变的问题，开发者添加了光学元件在两个倒置物镜的光路上，但是由于较长工作距离，以及调整畸变的光学元件的增加，使得分辨率受限。
八字开顶型双物镜成像示意图[6]
这种设计还存在以下问题：
1.横向分辨率受限：倒置双物镜结构要求照明物镜有较长工作距离，只能选择低 NA 物镜（NA≤1.0，对应分辨率约 330 nm），导致分辨率受限。
2.固定倍率：无法灵活切换物镜倍率，需专业的光学工程师手动切换。
3.应用场景受限：无法满足多尺度、多类型样本的成像需求。由于物镜摆放方式牺牲了大部分工作距离（WD），导致实际工作距离很短（如图所示），因此成像深度低，通常小于 200 µm，厚度较大的样本无法适用。且平台维护成本高。
第三代：单物镜光片显微镜——性能提升但应用场景受限
为了解决高 NA 物镜（油镜）无法使用的问题，研究者们开发了斜平面显微镜（OPM），并提升了光片性能，如费鹏教授团队研发的高通量贝塞尔斜平面显微镜（HBOPM）[7] ，通过单物镜斜照明光路设计，将照明与检测光路整合至同一高 NA 物镜（NA 1.3 硅油镜），实现油镜在光片成像中的应用，进一步突破了光片显微镜的分辨率极限，达到亚细胞级分辨率。且为倒置开顶式设计，可以兼容多种常规载具。
但仍存在以下问题：
1.无法切换倍率：由于光路中 O1 物镜和用于倾斜矫正的 O2、O3 物镜需要精密对齐，仅更换一级探测物镜不能实现倍率切换，而是需要更换全部物镜，重建整个光路，因此变倍问题仍需后续技术优化。
2.广泛使用受限：该成像系统结构复杂，组装、校准、维护困难，非专业光学实验室难以维护。
单物镜光片显微镜光路示意图[8]
🔬 光片显微镜的进化历程
第一代正交双物镜光片显微镜相对于共聚焦显微镜光毒性低，成像通量高，但其分辨率及易用性受限，操作复杂，学习成本高，使用场景单一。
第二代倒置双物镜解决了载具兼容性问题，但引入了荧光信号畸变的问题，牺牲了分辨率和实际成像距离（小于 200 μm），并且固定倍率，使用场景受限。
第三代单物镜进一步突破，解决了高 NA 物镜（油镜）无法使用的问题，提升了分辨率，但面临无法变换物镜倍率的限制，并且结构复杂，维护困难，导致广泛使用受限。
慧观 SmartView 单物镜光片显微镜进一步解决了不能变倍的问题
费鹏教授团队研发的 SmartView 显微系统采用单物镜光路设计[3]，超景深共焦探测，实现了片扫共聚焦，兼具共聚焦的操作习惯和光片的成像优势，颠覆了传统光片显微镜的使用局限。一方面，可以具有开放式的样本操作空间，使其不再需要特制样本载具，适用于共聚焦培养皿、多孔板、类器官芯片、载玻片等标准载具；另一方面，可以实现物镜倍率的灵活切换（4 ×-100 ×），可适配油镜。从亚细胞结构到活细胞，从类器官到全器官，SmartView 能满足不同应用场景的需求。结合光片显微镜光毒性低的特点，可实现对活细胞的精细动态和相互作用进行快速、三维、长时程地观测。使得光片显微镜的优势能够最大的发挥出来。
传统的光片显微镜成像受限于奈奎斯特采样定律，面临样本健康、时间分辨率、空间分辨率以及视场范围之间的权衡[9]。为了克服这些限制，SmartView 智能光片显微镜引入了智能成像方案、基于AI的高效图像处理算法和大数据处理与分析技术进一步提升生物图像的准确性和信息量。结合先进算法，光片显微技术可实现更精准的病理切片三维重建和图像分析，为疾病诊断和治疗方案制定提供了更科学的依据[10]。
SmartView 成像示意图
📜 SmartView 核心技术优势解析
🔬 高 NA 单物镜光片
目前已报道的单物镜光片显微镜的最高实验验证数值孔径（NA）为1.35[11]，SmartView 显微系统的数值孔径（NA）高达1.5（油浸物镜），横向分辨率达 220 nm。
💡 超薄无衍射光片
使用多重调制超薄无衍射照明光片[3]，最薄400 nm，使用这种新型光片可几乎消除旁瓣干扰，保证高轴向分辨率。
🛠 跨尺度联合成像
可自由变倍（4 ×-100 ×），无缝衔接亚细胞结构观测与全器官三维重建，覆盖从微观到宏观的全尺度研究需求（亚细胞→组织）。
🎯 全流程解决方案
提供从实验设计、荧光染色到成像分析的全流程解决方案，包括方案优化、多色标记指导和高端成像支持，确保高质量数据产出，技术团队全程护航。
第四代慧观 SmartView 智能单物镜
真正实现了"高分辨+低光毒+全兼容"三位一体：
✓ 高 NA1.5 油镜
✓ 兼容标准载具
✓ 灵活变倍（4 ×-100 ×）
全尺度联合成像（亚细胞→组织）
慧观 SmartView 应用场景
全场景通用：微观、介观、宏观
参考文献： （略）
